限制性核酸内切酶（又名限制性内切核酸酶）是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。

限制性核酸内切酶

别名：restriction endonuclease简称限制酶

酶反应：限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。

单位定义：在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。

性状制品不含非专一的核酸水解酶（由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示），这类酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。

限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成黏性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。Alu I的切割位点如下：

5'-A G^C T-3'

3'-T C^G A-5'

在已发现的限制性内切酶中，近百种酶的识别顺序已被测定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序，这种酶称为“异源同功酶”（isochizomer，同切限制内切酶；同裂酶）。应该注意的是，这些酶虽然有相同的识别顺序，但它们的切点并不完全一样。例如Xma I和Sma I都识别六核苷酸CCCGGG，但Xma I的切点在CCCCGGG，而Ema I的切点则在CCCGGGG，前者切割DNA分子，形成带有CCGG粘性末端的DNA片段，而后者并不形成粘性末端（而叫平末端）。当然，也有识别顺序和切点都相同的酶，如Hap Ⅱ、Hpa Ⅱ、Mno I，都在识别顺序CCGG内有一相同的切点，Hal Ⅲ和BsuR I同样在识别顺序GGCC内有一相同的切点。

限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力.

限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。

第一型限制酶

同时具有修饰（modification）及识别切割（restriction）的作用；另有识别（recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距离识别位（recognition site）可达数千个碱基之远。例如：EcoB、EcoK。

第二型限制酶

只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindⅢ。

第三型限制酶

与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对。例如：HinfⅢ。