数字全息显微镜（Digital holographic microscopy，简称DHM）是数字全息技术在显微领域的应用，也被称为全息显微术。与其他显微技术相比，数字全息显微镜并不直接记录被观测物体的图像，而是记录含有被观测物体波前信息的全息图，再通过计算机对所记录的全息图进行数值重建来得到被测物体的相位和振幅（光强）信息，进而完成数字三维重构。打个形象的比方来理解数值重建这个过程，就是利用计算机算法代替传统光学显微镜中的成像透镜。其他一些同数字全息显微技术相关的显微术包括干涉显微镜（Interferometric microscopy）、光学相干断层扫描技术（Optical coherence tomography，简称OCT）以及衍射相差显微镜（diffraction phase microscopy）。这些显微技术的共同点是都有一束参考波前，用来同时获得振幅和相位信息，信息被数字图像传感器采集，再通过计算机重建形成被测物体的图像。与之相比，传统的光学显微镜由于没有参考波束，只能记录振幅（光强）而没有相位，因此并不能读取物体的三维信息。

中文名：数字全息显微镜

外文名：Digital Holographic Microscopy

特点：动态三维形貌或者四维形貌

应用领域：表面形貌,MEMS振动分析,活体细胞

图1、DHM的工作原理

数字全息显微镜DHM的工作原理如图1所示，通过干涉产生的全息图被CCD传感器采集，经过电脑特定算法计算，重建微观物体的三维图像 。全息图（Hologram）是由若干干涉条纹构成的，而要产生干涉条纹需要使用单色相干光源，比如说激光。

通过激光器发出的激光主要有两种典型的光路布局，反射式和透射式。

反射式光路

图2、反射式DHM

反射式光路如图2所示，从激光器发出的激光被分为两束光，一束通过多个反射镜直接投射到分光镜，称为参考光R；另外一束则照射物体表面，经物体反射后携带表面形貌的波前（相位和振幅）信息，并通过显微物镜返回分光镜，称为物光O。参考光R和物光O在经过分光镜时产生干涉条纹形成全息图，并由CCD传感器记录。

透射式光路

图3、透射式DHM

透射式光路 如图3所示，与反射式相同的是激光开始都被分为两束，参考光R和物光O。与反射式不同的地方是，物光O是穿透物体之后再与参考光R形成干涉条纹。因此透射式光路要求物体对此波长的激光来说是透明的。

数字全息显微镜相比其他显微术，比如激光共聚焦显微镜（Laser confocal microscopy）、白光干涉仪（White light interferometry，WLI）和激光多普勒测振仪（Laser doppler vibrometer, LDV），有以下一些独特的优势：

数字自动聚焦

图4、DHM数字自动聚焦原理

传统的自动聚焦都是通过机械方式调节焦距来寻找希望聚焦的像面。不同的是，在全息成像中，单张全息图即包含了全部像面的信息，可以理解为是多层像面的叠加，这样就允许通过数值算法在计算机上自动选取需要聚焦的像面，因此称之为数字自动聚焦 ，如图4所示。这项功能使得数字全息显微镜抓取图像速度极快，因为省去了机械扫描寻找聚焦像面的过程。记录下来的全息图也允许用户在后期处理时重新寻找聚焦像面，有报道称这种方法能提高分辨率和图像质量 。

激光度量衡

光的波长是一种极其精确稳定的参照长度，早在1960年，国际单位制就已经使用氪86（氪的一种放射性同位素）的放射线波长作为长度度量衡的标准 。数字全息显微镜利用干涉滤波产生的极其稳定的单色激光，以此波长作为度量衡测量微观结构，测量精度可以达到皮米级 。

非扫描式显微

数字全息显微镜能够实现三维形貌的实时呈现，得益于它非扫描机制 。抓取单张全息图的时间是由相机的快门速度决定的，因此数字全息显微镜能够轻松实现普通视频速率，比如30帧/秒。而利用超高速相机，甚至能达到1000帧/秒的抓取速率 。

相移显微

有别于相差显微镜， 数字全息显微镜是基于独特的相移显微原理 。光波在经过物体表面反射或者透过物体之后，受物体表面形貌或者是物体内部不同物质折射率的影响而产生相移，这样就携带上了物体的三维特征。

无须细胞标记

透明样品，比如说细胞，利用传统的相衬显微镜只能进行观测。透射式的数字全息显微镜记录光在经过细胞之后的相移信息，不仅能观测细胞，还能进行三维重建和量化分析，因此也被称为量化相衬显微法 。细胞中的相移是由细胞内不同组织细微折射率的变化引起的，因此数字全息显微镜观测细胞无须对细胞进行任何标记，比如荧光染色，纳米颗粒或是辐射，这样不会对被观测细胞造成任何损伤或是外在影响 。

独特光路设计

和其他干涉技术一样，数字全息显微镜产生干涉的前提是两束光的光程差要小于相干长度。由于观测不同大小物体需要使用不同放大倍数的物镜，因此物光O的光程会因此改变。数字全息显微镜能根据不同物镜自动调节参考光R的光程，使得两束光的光程差总是符合产生干涉的条件，这种设计也使得各物镜下达到共焦的效果 。

经过20世纪初的十多年发展，数字全息显微镜已经在各领域内拥有众多成功案例，这些领域归结起来主要涵盖了无标记生物细胞检测 、材料表面度量 、微系统与微机电系统多维振动分析 、动态形貌测量 、微光学元件检测 等。

无标记生物细胞观测

图5、DHM测量单个血红细胞三维形貌

得益于数字全息显微镜对生物细胞非侵入式的视觉化量化分析能力，多种在生物医药领域的应用已经得到广泛的关注。例如图5所示，数字全息显微镜可以测量单个血红细胞的三维形貌，由于无需扫描，测量过程是实时的，因此也可以对多细胞进行动态跟踪分析 。图6则展示了数字全息显微镜对酵母菌的动态跟踪，可以三维实时观测酵母菌的移动和细胞分裂 。

图6、DHM对酵母菌动态跟踪

材料表面度量

图7、DHM测量表面粗糙度

数字全息显微镜能够根据国际标准化组织ISO制定的表面粗糙度标准 进行有效测量，如图7所示。根据ISO定义的表面粗糙度，只有大于定义长度或范围内的粗糙度测量才符合标准。数字全息显微镜能够通过高倍物镜捕捉有限视场内的粗糙度，并结合图像拼接达到定义长度或范围的方式，达到ISO表面粗糙度测量的标准 。

微系统与微机电系统MEMS多维振动分析

图8、DHM同时检测MEMS器件面内和离面运动

数字全息显微镜在记录全息图时也记录下了图上每个像素点的三维信息，因此能够实现对每个像素点的三维同步实时跟踪，在测量微系统与微机电系统MEMS的多维振动应用上体现了优势。对于离面（Out-of-plane）运动的测量达到了MEMS激光测振仪（也被称为MEMS分析仪）的精度，而对于面内（In-plane）运动的测量精度则远远超过其他各种MEMS分析仪的测量精度，达到了1纳米 。如图8所示，数字全息显微镜实现了对MEMS器件面内和离面运动同步实时跟踪。数字全息显微镜在频闪模式下还能记录在高频谐振下MEMS的不同模态，如图9所展示的MEMS悬臂梁不同频率下的谐振模态。

图9、DHM测量MEMS悬臂梁不同谐振模态

动态形貌测量

图10、DHM动态三维测量表面凹孔

数字全息显微镜可以实现亚纳米精度下的动态三维形貌测量，实时速率取决于相机捕获图像速率，最高可以达到1000帧/秒。数字全息显微镜的纵向相干长度大，因此无需纵向扫描，即能实现三维成像，这是数字全息显微镜对比于其他三维显微技术最独特的优势 。如图10所示，数字全息显微镜实时测量样品表面凹孔。

微光学元件检测(表面形貌测量,折射率)

图11、DHM测量微透镜阵列

数字全息显微镜在表征微光学元件的应用方面也具有独特优势，特别是透射式DHM，由于使用投射折射原理，相比于使用反射原理的反射式DHM，对于微光学元件的可测量边界角度大大增加。图11展示了数字全息显微镜测量微透镜阵列 。

数字全息显微镜 (DHM) 采用非扫描 (non-scanning) 技术，全视场瞬态成像四维量测，单帧全息图包含三维形貌信息，纵向亚纳米测量精度由激光本征波长决定，使用普通显微物镜便于维护保养。白光干涉仪(White light interferometer)采用垂直扫描(vertical scanning)技术，利用干涉条纹对被测样品进行机械垂直扫描来获得静态三维形貌信息，使用特殊干涉物镜并无法显示动态四维形貌。共聚焦显微镜(Confocal Microscope)同样采用扫描技术测量静态三维形貌，单张测量时间较长因此也无法实现四维形貌测试。激光多普勒测振仪（Laser doppler vibrometer）则采用单点测量，需横向扫描得到样品多点振动信息，受激光斑点大小影响，对于微小面内振动（in plane）的测量精度有限。

全息技术最早是由Denis Gabor于1947年发明的，当时他提出了创新的全息技术用于改进电子显微镜 ，他本人因这项发明于1971年获得了诺贝尔物理学奖 。

上世纪60年代末到70年代初，陆续出现了关于数字全息概念的报道，即利用数字成像取代传统胶片曝光的方式来记录全息图，之后再通过数值重建来还原物体图像 。然而，当时的数字成像水平和计算机数值处理能力远远不能满足数字全息的实用化，因此在经历了最初几年的研究热潮之后，数字全息技术陷入了沉寂。不过，对数字全息技术的研究并没有中断，而是逐渐细分为两个不同的方向：一是由全息图数值重建物体图像，二是由物体三维模型数值计算出全息图。这两个方向并行发展到今天，即是我们所说的数字全息显微（DHM）和计算机生成全息图（Computer-generated Holography，检测CGH）。

到了上世纪90年代中期，数字成像传感器和计算机处理能力有了大幅度的发展和提高，但当时的成像传感器主要是兼容各种彩电制式（PAL、NTSC或者SECAM）的低像素传感器，只能够勉强满足数字全息显微的要求，离实用化相距甚远 。最早关于数字全息显微应用的报道来自瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）的Etienne Cuche（现为瑞士Lyncée tec公司CTO） 。

给数字全息显微技术带来革命性发展的是20世纪初数码照相机的普及，市场被需求所驱动不断推出各种低成本高像素的CCD或者CMOS图像传感器。与此同时，在全息技术中关键的激光器也受益于半导体产业的发展，出现了各种超小型高性能的激光二极管，为数字全息技术的普及和实用化提供了必要条件。在这之后，诞生了最早几家提供数字全息显微技术的商业公司，4Deep inwater imaging, Phase Holographic Imaging, 和Lyncée tec。其中瑞士Lyncée tec是市场上最早也是同时提供透射式和反射式专业全息显微镜的公司，DHM®为其公司注册商标。